PCR檢測步驟

1.將參照基因與待測目的基因片段等比例連接，克隆到同一個(gè)質(zhì)粒載體上，構建一種可同時(shí)用于參照基因以及待測目的基因擴增檢測的標準品，并將所得標準品按照濃度梯度稀釋后同時(shí)用于繪制參照基因以及待測目的基因的標準曲線(xiàn)；

2.待測樣本與步驟1所述標準品經(jīng)同步進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴增后，目的基因與參照基因按照各自的標準曲線(xiàn)計算各自的拷貝數，計算待測樣本的目的基因與參照基因拷貝數比值，即得目的基因的拷貝數相對定量檢測結果。

其中步驟1為：將參照基因與待測目的基因片段等比例連接，克隆到同一個(gè)質(zhì)粒載體上，構建一種可同時(shí)用于參照基因以及待測目的基因擴增檢測的標準品，并將所得標準品按照濃度梯度稀釋后同時(shí)用于繪制參照基因以及待測目的基因的標準曲線(xiàn)。

其中所述參照基因為本領(lǐng)域常規參照基因，較佳地管家基因，優(yōu)選地為RPPH1的擴增區域，其中所述質(zhì)粒載體為本領(lǐng)域常規質(zhì)粒載體，較佳地為PCR克隆載體，優(yōu)選地為T(mén)A cloning載體，所述TA cloning載體較佳地為pMD18-T載體。其中所述標準品的核酸序列如序列表中SEQ ID NO:6所示。所述的等比例較佳地為1：1。由于標準品中待測目的基因與參照基因的比例為1:1，解決了目前相對標準曲線(xiàn)法應用中目的基因與參照基因的濃度比例關(guān)系難以控制的問(wèn)題，提高HER2基因擴增檢測的可靠性。

步驟2為：待測樣本與步驟(1)所述標準品經(jīng)同步進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴增后，目的基因與參照基因按照各自的標準曲線(xiàn)計算各自的拷貝數，計算待測樣本的目的基因與參照基因拷貝數比值，即得目的基因的拷貝數相對定量檢測結果。

其中所述待測目的基因為本領(lǐng)域常規待測目的基因，較佳地為腫瘤或者疾病的特異性基因，更佳地為HER2基因的擴增區域，所述熒光定量PCR擴增為本領(lǐng)域常規熒光定量PCR擴增方法，所述熒光定量PCR擴增方法較佳地為多通道熒光定量PCR擴增，更佳地為雙通道熒光定量PCR擴增。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實(shí)時(shí)監測整個(gè)PCR進(jìn)程，后通過(guò)標準曲線(xiàn)對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。實(shí)時(shí)熒光定量PCR的化學(xué)原理包括探針類(lèi)和非探針類(lèi)兩類(lèi)，探針類(lèi)是利用與靶細胞序列特異性雜交的探針來(lái)指示擴增產(chǎn)物的增加，非探針類(lèi)是利用熒光染料或者特異性設計的引物來(lái)指示擴增的增加。運用該技術(shù)可以對DNA、RNA樣品進(jìn)行定量（包括絕對定量和相對定量）和定性分析。

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