單個(gè)二倍體細胞

在分析單精zi以前，Li等人對個(gè)體二倍體細胞內的β珠蛋白基因進(jìn)行過(guò)研究。兩 個(gè)組織培養細胞株用于這些實(shí)驗。其中一個(gè)純合是鐮刀型細胞密碼子6（βS）發(fā)生突 變，另一個(gè)純合子則來(lái)源于正常的βB等位基因。擴增含有密碼子6的β珠蛋白片段的 引物，及能夠區別這兩個(gè)特異的等位基因的寡核苷酸探針（ASO）已經(jīng)報道過(guò)。βA純 事細胞和βB純合細胞和βS純合細胞在同一組織培養瓶中共同培養數天。將用相差顯 微鏡觀(guān)察到的混合培養的單個(gè)細胞轉入溥塑料胡管內。

分別將單個(gè)細胞轉入含裂解液 的PCR管中，保溫后，加入PCR緩沖液，緩中有四種dDNP．Taq dna聚合酶和擴增已知 珠蛋白基因的PCR引物。95℃10分鐘變性靶DNA，然后根據已發(fā)表方法的改進(jìn)方案進(jìn)行 50全循環(huán)的擴增。通過(guò)打點(diǎn)雜交，等量的擴增產(chǎn)物打點(diǎn)于尼龍膜后，擴增產(chǎn)物分別與 βA和βS的探針雜交。所分析的37個(gè)細胞中，84％細胞只與βA和βS探針雜交，雜交 強弱各不相同；19個(gè)與βA探針．12個(gè)與βS探針雜交。

12個(gè)以水作空白對照的反應管 中瓜呈陰性，它表明忽略不記DNA的污染。沒(méi)有與兩種探針都雜交的樣品，它暗示轉 入到反應管中的單個(gè)細胞，而且組織培養基中存在的從βA或βS細胞中裂解出來(lái)的 DNA并未吸附在單個(gè)細胞上。

單個(gè)細胞的pcr擴增產(chǎn)生的β珠蛋白基因的數量通過(guò)與已知攜帶蛋白基因的質(zhì)粒 DNA樣品在雜交模上的雜交信號的強度進(jìn)行比較確定。據估計PCR反應開(kāi)始時(shí)，一個(gè)二 倍體細胞珠蛋白DNA量（3.0X10-24摩爾）在5－500毫微微摩爾之間，每個(gè)PCR循環(huán)以 平均效率65％計算，經(jīng)50個(gè)循環(huán)后它的DNA相當于平均擴增了7.6×1010倍?？紤]到擴 增的程度之大，因此排除任何可能的污染對于單個(gè)細胞的分析十分關(guān)鍵。

單精zi的分析

我司等人隨后對位于染色體19編碼LDL受體(LDLr)的基因的雜合體單精zi的基因型 進(jìn)行分析。根據已知的DNA序列，他們用PCR和ASO分析檢測LDLr的RFLP。PCR的引物和 探針以前已有報道。單個(gè)精zi的分離與二倍體細胞的分離方法一樣，經(jīng)蔗糖梯度 離心得到純化的精zi，精zi于－20℃可保藏8個(gè)月。

顯微鏡下將單個(gè)精zi吸入毛細塑 料針管內，然后轉入試管內以作裂解。裂解的方法與發(fā)表的方法沖液(50mM KCL， 10mM Tris.HCL，pH8.3，2.5mM MgCl2，0.1mg/ml明膠），0.05mg/ml蛋白酶K，20mM DTT和1.7μM SDS。37℃保溫1小時(shí)，加入pcr反應物以前，樣品加熱到85℃。PCR擴 增。

對80個(gè)精ziLDLr基因型已作過(guò)分析。55%的雄配子顯示出雜交信號。22個(gè)攜帶 LDLr等位基因，21個(gè)攜帶LDLr2基因。僅一個(gè)與兩種探針雜交都呈陽(yáng)性。16支對照反 應管中加入所有反應試劑但沒(méi)有精zi，結果無(wú)雜交信號出現。